Spektroskopia ramanowska (RS, z ang. Raman Spectroscopy) jest uniwersalną techniką analityczną wykorzystywaną w wielu obszarach badawczych. Stanowi cenne i potężne narzędzie pozwalające na charakterystykę chemiczną badanych materiałów, dostarczając informacji w sposób nieniszczący oraz niewymagający znaczników, co czyni ją niezastąpioną w wielu dziedzinach szeroko rozumianej biotechnologii.
Podstawy spektroskopii ramanowskiej
Spektroskopia ramanowska (RS) opiera się na nieelastycznym rozpraszaniu światła przez molekuły badanej próbki. W wyniku interakcji promieniowania z materią, niewielka część fotonów zmienia swoją energię. Informacja ta zapisana jest w formie widma, które jest unikalne dla każdej cząsteczki i stanowi chemiczny „odcisk palca”. Taki pomiar umożliwia identyfikację ugrupowań chemicznych oraz analizę składu badanych układów. Cecha ta w połączeniu z możliwością analizy zarówno próbek w postaci ciała stałego jak i cieczy oraz gazów sprawia, że spektroskopia ramanowska jest doskonałą techniką do analiz jakościowych znajdując zastosowanie w różnych obszarach nauki oraz przemysłu.
Spektroskopia ramanowska stanowi cenne i potężne narzędzie analityczne użyteczne w dziedzinie biotechnologii ze względu na szereg istotnych zalet. Wśród nich należy wymienić brak bądź ograniczony do minimum proces przygotowania próbki oraz brak konieczności znakowania, co nie tylko redukuje czas analizy, ale również minimalizuje ryzyko wprowadzenia do układu zanieczyszczeń. Nieniszczący charakter analizy umożliwia z kolei prowadzenie pomiarów bez ryzyka uszkodzenia próbki, co jest kluczowe w badaniach układów biologicznych takich jak komórki czy też szczególnie cennych lub delikatnych materiałów. W przypadku próbek biologicznych nie bez znaczenia jest niska aktywność ramanowska wody, dzięki czemu możliwe jest prowadzenie pomiarów w warunkach zbliżonych do fizjologicznych. Co więcej, w połączeniu z mikroskopią konfokalną, spektroskopia ramanowską umożliwia mapowanie z wysoką rozdzielczością przestrzenną dostarczając informacji nawet na poziomie subkomórkowym.
Pomimo zalet spektroskopia ramanowska, jak każda metoda badawcza, ma też pewne wady, szczególnie w kontekście zastosowania w badaniach z dziedziny biotechnologii. Podstawowym ograniczeniem tej techniki jest jej niska czułość w porównaniu z innymi technikami (np. spektroskopią UV-ViS). W przypadku próbek, w których stężenie analitu jest na niskim poziomie, uzyskanie sygnału ramanowskiego może wiązać się z czasochłonnym pomiarem bądź też okazać się niemożliwe. Ponadto, trudności mogą sprawiać próbki zawierające w składzie np. substancje pomocnicze, które często posiadają podobne i mało charakterystyczne sygnatury ramanowskie. Dodatkowym efektem utrudniającym pomiar, jest zjawisko fluorescencji wywołane przez obecność niektórych substancji, szczególnie barwnych oraz zanieczyszczeń. Tło fluorescencyjne może maskować pasma ramanowskie, co sprawia, że otrzymane widma są nieczytelne. Co więcej, RS wymaga zaawansowanego i kosztownego sprzętu oraz specjalistycznej wiedzy w prowadzeniu pomiarów oraz interpretacji uzyskanych wyników. Stanowi to barierę w powszechnym zastosowaniu tej techniki w laboratoriach. Dlatego też warto takie badania zlecać do firm, które posiadają zarówno odpowiednią aparaturę jak i doświadczonych specjalistów, i oferują badania kontraktowe.
Analiza biomolekuł i diagnostyka medyczna
W sektorze biotechnologicznym spektroskopia ramanowska znajduje zastosowanie nie tylko w diagnostyce, ale również w monitorowaniu działania leków, przyspieszając rozwój nowych rozwiązań terapeutycznych. Pozwala na nieinwazyjne badanie próbek biologicznych w warunkach bliskich fizjologicznym, co czyni ją cennym narzędziem w analizie białek, kwasów nukleinowych czy lipidów. Umożliwia uzyskanie szczegółowych informacji o strukturze i dynamice molekularnej, pozwalając na lepsze zrozumienie funkcji biologicznych tych cząsteczek. W kontekście białek, dostarcza informacji o zmianach konformacyjnych oraz tworzących się agregatach (np. fibrylach).
W ostatnich latach spektroskopia ramanowska jest coraz chętniej rozwijana w kontekście identyfikacji biomarkerów stanów chorobowych, dzięki czemu znajduje szerokie zastosowanie w diagnostyce medycznej. Dzięki swojej wysokiej rozdzielczości i czułości pozwala na wczesne wykrywanie powstających patologii oraz monitorowanie postępów terapii. Szczególnym zainteresowaniem cieszy się wykorzystanie tej metody do rozróżniania komórek zdrowych i nowotworowych, a w perspektywie możliwość zastosowania śródoperacyjnego do określania granic tkanek zmienionych chorobowo. Literatura naukowa potwierdza, że spektroskopię ramanowską można zastosować z powodzeniem do identyfikacji nowotworów piersi, prostaty, płuc, skóry, szyjki macicy, jelita grubego i innych patologicznie zmienionych tkanek.
W ostatnich latach dokonano także postępu w wykrywaniu biomarkerów chorobowych w płynach ustrojowych, takich jak pełna krew, osocze, ślina czy mocz. Taki sposób identyfikacji zyskał nazwę płynnej biopsji. Analizy te są użyteczne nie tylko w kontekście diagnozowania chorób, ale także w badaniach mechanizmów lekooporności, stratyfikacji pacjentów oraz przewidywaniu skuteczności terapii. Warto wspomnieć, że obecnie wiele takich badań prowadzonych jest przy użyciu ramanowskiej spektroskopii wzmocnionej powierzchniowo, tzw. SERS (z ang. Surface-Enhanced Raman Spectroscopy), czyli technice spektroskopii ramanowskiej, w której wykorzystuje się powierzchnie metaliczne do zwiększenia czułości detekcji. Dzięki zastosowaniu SERS, możliwa stała się detekcja niewielkich biomolekuł, takich jak fragmenty DNA czy RNA oraz bakterie i wirusy w złożonym materiale biologicznym. Opracowanie specjalnych sensorów, a nawet całych miniaturowych układów doświadczalnych (z ang. „lab-on-chip”), pozwala na specyficzne oraz jednoczesne wykrywanie wielu związków w jednej próbce, co czyni ją bardzo przydatną w diagnostyce medycznej. Miniaturyzacja tego typu urządzeń niesie ze sobą liczne korzyści, w tym zwiększoną szybkość i czułość diagnostyki, automatyzację procesów oraz, co najważniejsze, zmniejszenie kosztów analizy.
Spektroskopia ramanowska może być także stosowana do wykrywania biomarkerów chorób sercowo-naczyniowych oraz neurodegeneracyjnych, takich jak choroba Alzheimera. Analiza otrzymanych widm może dostarczyć informacji o zmianach w składzie lipidów i białek, wskazujących na postępujące procesy zapalne czy rozwój blaszki miażdżycowej, które mogą prowadzić do zawałów serca lub udarów. Z kolei w badaniach nad chorobą Alzheimera, RS jest wykorzystywana do monitorowania agregacji białek amyloidowych, które są biomarkerem tej choroby. Wczesne wykrywanie tych zmian przyczynia się do szybszej diagnozy oraz pozwala na lepsze zrozumienie mechanizmów choroby, co jest kluczowe w opracowywaniu nowych terapii.
Mimo ogromnego potencjału spektroskopii ramanowskiej i SERS należy zauważyć, że technika ta wciąż wymaga dalszych badań, głównie w kierunku standaryzacji procedur pomiarowych oraz potwierdzenia specyficzności wykrywania biomarkerów. Szczególny nacisk musi być położony na opracowanie odpowiednich algorytmów, które mogą być wykorzystane do identyfikacji wzorców spektralnych charakterystycznych dla danej choroby.
Badania nad lekami
Spektroskopia ramanowska znajduje również szerokie zastosowanie w sektorze farmaceutycznym, który ze względu na rodzaj dostarczanych produktów stanowi szczególną gałąź przemysłu. Produkcja leków, od której zależy zdrowie i życie ludzi, podlega ścisłej kontroli opartej na określonych metodach badawczych. Nadal jednak poszukiwane są innowacyjne metody oraz rozwiązania, mogące dostarczyć pełniejsze informacje o opracowywanych substancjach. Na tym polu spektroskopia RS, obok spektroskopii FTIR, pełni wyjątkową rolę. Powodem tego jest fakt, że większość związków stosowanych w produkcji leków wykazuje charakterystyczne widma z dobrze rozdzielonymi pasmami, umożliwiając analizę jakościową (analiza składu chemicznego) oraz pół-ilościową. Ta cecha jest szczególnie ważna, jako że formy końcowe produktów leczniczych są zwykle złożonymi mieszankami substancji aktywnych oraz pomocniczych. Co więcej, przy zaangażowaniu spektrometru ramanowskiego połączonego z mikroskopem konfokalnym możliwe jest uzyskanie informacji o dystrybucji zidentyfikowanych substancji. Zebrane w ten sposób dane pozwalają na ocenę homogeniczności rozmieszczenia poszczególnych składników, analizę wielkości agregatów, jednolitości otoczki czy powtarzalności procesu powlekania tabletek. RS jest także z powodzeniem stosowana do weryfikacji tożsamości surowców i potwierdzenia ich jakości oraz czystości. Taka ocena bazuje na porównaniu widm analizowanego surowca z jego widmem referencyjnym.
Szczególnie ważnym aspektem produkcji i kontroli jakości leków jest monitorowanie procesów krystalizacji oraz potwierdzenie bądź wykluczenie występowania różnych odmian polimorficznych API. Polimorfizm, czyli istnienie substancji o tym samym składzie chemicznym w różnych formach krystalicznych, jest fundamentalną cechą API, która wpływa na właściwości całego produktu leczniczego. Stoi za tym fakt, że różne odmiany krystaliczne mogą charakteryzować się odmienną rozpuszczalnością, stabilnością, higroskopijnością, co wpływa również na ich biodostępność. Dokładna charakterystyka substancji farmaceutycznych, szczególnie API, jest zatem niezbędna i zwykle wymaga zastosowania kilku metod. Jedną z nich jest spektroskopia ramanowska, która w sposób szybki i niedestrukcyjny pozwala odróżnić od siebie formy polimorficzne zarówno w surowcu jak i gotowym produkcie. Zagadnienie to opisaliśmy szerzej w artykule „Spektroskopia ramanowska jako narzędzie do badania polimorfizmu”, który jest dostępny na naszej stronie internetowej.
Możliwość identyfikacji składników, weryfikacji tożsamości chemicznej surowców, rozróżniania form polimorficznych, a także analizy dystrybucji oraz wielkości cząstek poszczególnych substancji wchodzących w skład danego produktu sprawiły, że technika ta stała się niezwykle użytecznym narzędziem w inżynierii odwrotnej leków (ang. reverse engineering) oraz wykrywaniu fałszerstw lekowych. Rozwój aptek internetowych oraz rosnący popyt na leki po przystępnych cenach przyczyniły się do tego, że podrabiane produkty stały się poważnym globalnym problemem, stwarzającym zagrożenie dla zdrowia pacjentów. Dodatkowo taka sytuacja nie tylko wpływa na wizerunek firm farmaceutycznych i pociąga za sobą straty finansowe, ale również prowadzi do osłabienia zaufania do systemu opieki zdrowotnej. Identyfikacja podrabianych leków stała się więc priorytetem zarówno dla organów regulacyjnych, jak i dla samych firm farmaceutycznych. Sfałszowane leki często posiadają zbliżony skład do oryginalnych jednak substancje aktywne często są w innych proporcjach bądź nieodpowiednich formach polimorficznych. Co więcej, zdarza się, że podrobione produkty zawierają inne substancje pomocnicze, związki toksyczne bądź zanieczyszczenia. Z wykrywaniem takich niezgodności w składzie i ze stwierdzeniem obecności substancji, które nie powinny występować w leku, doskonale radzi sobie spektroskopia ramanowska. Dzięki zaangażowaniu tej techniki możliwe jest skuteczniejsze przeciwdziałanie zagrożeniom związanym z fałszerstwami leków, co przekłada się na zwiększenie bezpieczeństwa pacjentów oraz ochronę rynku farmaceutycznego.
Inżynieria tkankowa
W ostatnim czasie na znaczeniu zyskuje również zastosowanie spektroskopii ramanowskiej w badaniach w zakresie inżynierii tkankowej jako uzupełnienie dotychczasowo stosowanych metod. Technika ta jest wykorzystywana głównie do oceny jakości tworzonych biomateriałów poprzez analizę składu chemicznego i weryfikację obecności określonych składników oraz do monitorowania wzrostu i rozwoju zewnątrzkomórkowej macierzy (ECM) na różnych rusztowaniach komórkowych i pod wpływem różnych warunków. Poprzez zaangażowanie obrazowania ramanowskiego możliwe jest określenie rozmieszczenia ECM na przekrojach modyfikowanych tkanek, co w efekcie pozwala na optymalizację warunków hodowli tkankowej. Przedsiębiorcy z branży biotechnologicznej mogą dzięki temu oferować lepszej jakości produkty inżynierii tkankowej, co przekłada się na większą satysfakcję klientów i lepsze wyniki finansowe.
Inne zastosowania spektroskopii ramanowskiej
Spektroskopia ramanowska jako wszechstronna technika analityczna znajduje również zastosowanie w branżach powiązanych z biotechnologią – m.in. w przemyśle spożywczym, kosmetycznym czy w ochronie środowiska. W analizie żywności wykorzystywana jest m.in. w badaniach składu chemicznego produktów spożywczych, co pozwala na monitorowanie ich jakości oraz potwierdzenie autentyczności. Fałszowanie żywności ze względu na ekonomiczne korzyści nie jest zjawiskiem rzadkim i polega na niewłaściwym etykietowaniu, podrabianiu i celowym zastępowaniu surowców tańszymi zamiennikami o niższej jakości czy wprowadzaniu substancji zmieniających skład produktów spożywczych. Wykrywanie zafałszowań z pomocą RS opiera się głównie na identyfikacji niedozwolonych i niezgodnych z etykietą dodatków czy stosowanie zamienników. W literaturze można spotkać się z wieloma doniesieniami o skutecznym wykorzystaniu RS w analizie autentyczności produktów spożywczych np. miodu czy oliwy z oliwek.
Współczesny przemysł kosmetyczny stawia czoła nowym wyzwaniom w związku z rosnącymi wymaganiami klientów oraz zwiększającą się ilością kosmetyków wprowadzanych na rynek. Poza rozwojem innowacyjnych rozwiązań, istotna jest również analiza skuteczności ich działania oraz stwierdzenie czy dany składnik produktu kosmetycznego rzeczywiście dociera w skórze do miejsca, w którym pożądana jest jego aktywność. Ocena takiego działania – poza potwierdzeniem aktywności w badaniach in vitro – opiera się na analizie zdolności danej substancji do pokonywania bariery naskórka. Metodą badawczą pomocną w tym przypadku jest RS, która poza standardową analizą składu chemicznego produktów kosmetycznych, pozwala też na ocenę wnikania składników aktywnych w głąb skóry. Ułatwia to opracowanie skuteczniejszych produktów kosmetycznych oraz potwierdzenie tzw. claimów marketingowych. Przedsiębiorcy z branży kosmetycznej mogą dzięki temu oferować produkty o wyższej oraz potwierdzonej skuteczności, co przekłada się na większe zaufanie do marki.
Spektroskopia ramanowska ma również ogromny potencjał w niedestrukcyjnej analizie próbek wody, gleby i powietrza. Technika ta umożliwia identyfikację toksycznych substancji chemicznych oraz pośrednio monitorowanie ich stężeń. Jest używana między innymi do wykrywania zanieczyszczeń organicznych (np. związki ropopochodne i chlorowcopochodne) oraz identyfikacji mikroplastiku w próbkach środowiskowych. Należy wspomnieć, że wykrywanie oraz monitorowanie w sposób bezpośredni zanieczyszczeń związanych z metalami ciężkimi jest w przypadku RS niemożliwe, może natomiast pomóc w analizie związków kompleksowych i chelatów, które te metale tworzą w wodzie. Innym utrudnieniem w zastosowaniu RS w ochronie środowiska jest również niska czułość w porównaniu do innych technik analitycznych, co stanowi problem w przypadku występowania zanieczyszczeń w bardzo niskich stężeniach.
Podsumowując, przytoczone powyżej przykłady potwierdzają, że spektroskopia ramanowska to wszechstronna technika znajdująca zastosowanie w licznych dziedzinach biotechnologii. Może być przydatna analizie i kontroli jakości leków, diagnostyce chorób, badaniu biomateriałów, charakterystyce polimerów, materiałów ceramicznych, kompozytów oraz wielu innych. Unikatowe cechy tej metody, takie jak specyficzność, nieinwazyjny charakter, oraz połączenie informacji chemicznej z dystrybucją przestrzenną sprawiają, że jest coraz częściej i chętniej wykorzystywana nie tylko w badaniach naukowych, ale przede wszystkim w prowadzeniu rutynowych analiz.